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亚美体育app:经验分享:细胞培养过程分析技术(PAT)简介

发布时间:2022-08-16 12:57:09 7人阅读 来源:亚美体育app下载 作者:亚美体育app官网

  随着生物制药行业的快速发展,用于药物生产的细胞大规模培养技术发展迅速,基于质量源于设计背景,细胞培养的过程参数及控制是产品质量的关键。此外,细胞培养工艺在产业化过程面临着工艺放大与技术转移,定性研究与工艺验证等实际问题,未来大规模细胞培养工艺的开发,将进一步借助强调在生产工艺流程中直接应用过程分析技术PAT(Process Analysis Technology)过程分析技术,本文旨在浅述细胞大规模培养PAT技术的应用和研究进展。

  2004 年FDA对过程分析技术发布了指导性文件[1] , 文中描述了 PAT 的定义:“一个通过即时测量原料、过程中物料和过程本身的关键质量指标来实现设计、分析和生产控制的系统,目的是确保最终产品的质量”。2005 年 IBM 全球医药行业用户大会上,提到 10 年内将改变制药行业的革命性技术的五项技术之一:PAT。PAT 是符合质量源于设计这一基本原则的,在提高生产效率的同时,降低质量和法规风险。

  过程分析技术(PAT)通过对过程的关键参数(CPP)与关键性能指标(KPI)充分了解、明确定义和持续监控,以确保始终达到最终产品的预定义关键质量特性(CQA)。PAT实时衡量原材料、生产用料与过程中的关键质量与性能指标。精心设计的基于PAT的过程是稳定的,可确保关键参数与指标始终位于预先描述的限值范围内,以确保产品质量与过程安全。PAT是质量源于设计(QbD)体系中的一个重要元素。PAT是化学、物理、微生物、数学与风险分析元素的正交应用,从而全面了解与控制过程。PAT采用各种工具,例如:光谱与色谱成分分析仪、固定用途传感器、自动化与统计数据分析以及总体知识管理方法,这些技术与方法旨在以实时或接近实时的方式提供信息。由于PAT的目的是提高制造产品的安全性与质量,因此必须将其纳入到细胞大规模生产前的工作中,例如早期与后期过程开发与过程放大生产。

  目前,细胞大规模培养技术应用到PAT的技术包括用于pH、DO、CO2、温度与压力的单一用途传感器,活细胞密度在线分析仪,尾气分析,提供粒度、粒度分布以及原位成像的光学探头,全面了解反应以及实时监控过程的成分监控装置,例如:FTIR光谱与拉曼光谱仪。当然,基于一些条件限制,细胞大规模培养技术常见的PAT技术既是pH、DO、CO2、温度与压力的单一用途传感器和活细胞密度在线分析仪。在国内,以梅特勒公司(Mettler Toledo)与哈美顿公司(Hamilton)对于pH、DO、CO2的单一传感器在线监测最为常见,应用最为广泛;对于活细胞密度在线分析仪,市场常见为赛默飞Futura在线活细胞分析,英国ABER原位活细胞浓度在线分析仪与哈美顿公司(Hamilton)的Nanotech Biomass System在线活细胞密度分析仪。

  细胞密度是细胞大规模培养过程中最重要的监控参数。目前细胞密度的分析可以分为在线和离线两类。在离线分析中,通常是在一定体积比的样品中通过相应的细胞计数仪器进行细胞计数来计算细胞密度,但这种方法容易受到外界因素的影响,不能反映培养过程中活细胞密度的变化。作为在线分析,目前主要有近红外光谱法、荧光分析法、电容法等。其中电容法在测量时受细胞组成形式、气泡、颗粒等因素的影响较小,已经成功应用于细胞培养过程中[2]。

  在线活细胞密度分析仪依靠介电常数和介电谱更加准确地确定活细胞浓度[3],由于正常活细胞具有完整的细胞膜,胞内的带电荷离子在特定频率下的交变电场可以产生极化现象,使得活细胞可以被看作是极小的电容器。通过检测电容信号,再经过信号处理,可以得到相应的电容值,其大小与环境中的活细胞量成正相关,因此电容值就可以用于测量活细胞浓度[4]。利用基于近红外和中红外的光谱探针,可以对复杂的细胞培养液成分进行评估,如营养物质、副产品、活力以及细胞和重组产物的浓度[5]。

  活细胞密度分析仪基于PAT的优化工艺相比于传统的方法更高效,Li等[6]在植物细胞低温保藏中采用活细胞密度分析仪快速分析冻存后细胞的活性与密度,其细胞活性与采用活细胞密度分析仪分析的电容值具有很好的一致性,证实了活细胞密度分析仪的可靠性。在疫苗生产方面,化磊召等[7]在昆虫细胞-杆状病毒载体表达系统(BEVS)上生产病毒样颗粒亚单位疫苗(VLPs),结合PAT技术利用活细胞密度分析仪表征培养过程中的活细胞密度。由于细胞的代谢是细胞培养过程中重要的变量,而细胞线粒体的功能活性,细胞的葡萄糖比消耗速率和比氧消耗速率在测量时存在一定的滞后性,因此他们引入了活细胞电极的在线特征频率f值进行分析,该值与比氧消耗速率成正相关,实现了细胞代谢活性状态的在线监测。以f值的变化为依据确定最佳补料时间,可以使最高活细胞密度达到2.1×107 cells/mL,相比于分批培养的最高活细胞密度1.2×107 cells/mL提高了75%。

  通过选择合适的分析模式,活细胞密度分析仪能在线、准确地检测各类发酵过程中的活细胞密度,与传统离线方法测得的数据具有良好的线性关系,并与生理代谢参数OUR、 CER、比生长速率、糖耗速率、粘度和产物量线性相关。同时建立了电导率与发酵液中主要营养物质含量之间的关系。研究了工艺条件对活细胞密度分析仪测定的影响,发现温度、通气、搅拌转速和培养基的改变均会不同程度地对密度造成影响。通过公式的校正得出更为准确的数值,可以避免对生物过程产生错误的认识和判断,进一步优化生产或开发过程中工艺的过程控制。

  在生物反应器培养模型中,CO2的分析和监控至关重要。在CHO细胞等哺乳动物细胞培养过程中,溶解CO2浓度的理想操作范围通常为5 – 30 %,具体数值由培养过程和所使用的重组细胞系决定。在哺乳动物细胞培养过程中控制分析溶解 CO2,已被越来越广泛的接受。人体内CO2的浓度为 5%,进行细胞培养时,需要保持这个水平作为较低浓度。在生物反应器细胞培养的模型中,分析和监控CO2 从多个角度来看都被视为一个重要步骤,CO2富集可能会对细胞代谢过程以及目标蛋白质的生产和蛋白糖基化产生一定的负面影响。

  在细胞培养中控制溶解二氧化碳富集,目前常规做法是通入空气或氧气,特别是在大规模培养的生物反应器中,为了监控溶解CO2,通常会采集一个样本离线在血气分析仪(BGA)或生化分析仪(例如:NOVA)中测量。如果需要提供持续的观察结果,这种方法是需要通过频繁取样才能得到一定的梯度数据。此外,温度的变化以及样品取样和分析之间时间的延迟,也会影响到溶解CO2的水平,特别是在流体工艺中使用取样袋进行样品取样的时候,通常需要使用到封管机对管道的焊封,这对于取样和分析时间的延迟方面也是一种条件限制。这些问题不仅限于 BGA或NOVA,任何在线或离线的方法都有可能受到一些影响,妨碍我们去确定的溶解CO2的真正水平,只是相对于离线分析方法来说,在线分析方法能够更加趋近于真相。

  在细胞培养过程中,如果生物反应器中的溶解CO2浓度过高,会对细胞培养产生严重的负面影响,比如有害的代谢变化、生长抑制以及由此导致的生产效率低下。更确切地来讲,它还会改变重组蛋白质的糖基化模式,尤其是在采用哺乳动物细胞系表达模型时。溶解CO2含量较高时(200 – 250 mmHg),会成为哺乳动物的细胞毒素。如果没有对其进行快速纠正,会严重影响到批次的生产效率。如果溶解CO2浓度过低的情况虽然发生的几率不高,但由于三羧酸循环中天然细胞会产出CO2,溶解50%含量低(低于5 %)时会对细胞产生机械应力,也会对过程的生产效率造成负面影响。

  溶解CO2或乳酸累积过多时,通常可采用添加碱液的方式,将pH水平降低到目标范围内,或者通过注入空气或N2剥离液相中的CO2。根据不同的细胞系、生物反应器的规格、气体注入方法和工艺技术类型,可以采取不同的控制策略,提高细胞密度。在任何离线或旁线测量时,都有可能会出现取样和测样之间状态不同和时间延迟的问题。使用可提供准确、实时的测量。在线检测的数据可用于确定何时应该添加或去除CO2,不用考虑生物反应器的规格(H/D比例)、喷头设计、剥离所使用的气体类型或细胞系。有报告显示,精确的溶解CO2控制策略可提高细胞生长率,最高达到30 % 。

  光谱学和传感器与适当的分析工具相结合,对于生物过程的监控尤为重要,目前使用的光谱方法主要有紫外可见光、荧光光谱、红外光谱以及拉曼光谱。

  长期以来,红外光谱一直被用于固体、液体或气体样品中化合物的表征。对于细胞培养液,通常采用红外透射式测量。基于红外的测量是无损的,可用于实时监控培养过程中的培养基成分的改变。大多数基于红外光谱的传感器可以制作成原位探头,如蒸汽灭菌的pH或DO探头,并直接插入到生物反应器中,实时监控生物过程。一些研究报道了在CHO-K1培养过程中使用大量的数据对红外光谱校准,可以很好地估计葡萄糖和乳酸浓度。另外为了改进校准方法,并将校准模型扩展到更广泛的工艺中去,M. Milligan等使用不同的细胞系对不同的细胞代谢参数,例如细胞浓度、葡萄糖和乳酸浓度等进行修正[2]。

  红外光谱包括近红外(NIR)和中红外(MIR),虽然近红外和中红外光谱采样简单快捷,但近红外光谱产生的峰宽且重叠,使光谱的解释变得困难。中红外光谱的吸收较强,产生的光谱特征明显,然而水的干扰会使液相系统中样品的制备变得困难。拉曼光谱是通过分子振动测量在不同频率上非弹性散射的光量,具有很高的化学特异性,可以检测出低于近红外光谱所能检测到的化学物质,而且拉曼光谱不需要样品制备就可以很容易地应用于各种水体系,因此,拉曼光谱被认为是最有前途的复杂细胞培养系统在线分析的光谱方法。目前已经成功地使用原位拉曼探针测量葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、氨以及细胞密度,并在小规模生物反应器中使用拉曼光谱为细胞代谢的参数如葡萄糖浓度等建立偏最小二乘校准模型,将其应用于CHO细胞大规模补料培养。Eyster等基于拉曼光谱的营养控制策略,为了在生产单克隆抗体的补料分批培养CHO细胞过程中实现乳酸和葡萄糖的控制,建立拉曼光谱PLS模型。通过实时预测葡萄糖和乳酸浓度,将葡萄糖浓度控制在4 g/L,乳酸浓度在2 g/L时显著降低CHO培养过程中的百分之68的氨积累,同时提高了单克隆抗体半乳糖化百分之50的水平[2]。

  在另一个研究里,Kuystermans等[8]利用全自动样品处理器及流式细胞技术实时监测CHO细胞培养过程中的凋亡量,从而监控培养动态、提升产物产量及质量,该方法是一种新颖而有效的技术手段。Teixeir等[9] 利用原位二维荧光技术结合化学计量统计,监测哺乳动物细胞培养过程中的关键生物工艺参数,包括活细胞密度和重组蛋白浓度,据验证准确度达到 91% 以上,可实时监测细胞浓度和抗体滴度。Esmonde-White等[10]报道,利用表面增强拉曼光谱技术、以及拉曼光谱联合非线性模型预测控制器对CHO 细胞培养中营养物浓度等参数进行监控,正在从实验研究往 GMP生产应用上发展。另外,利用上述技术结合多变元数据分析手段,对生物反应器内培养液定期扫描,再通过预先建立的数学模型对过程参数实时监测,可以在实际生产中进行真正意义上的生物过程质量检测、分析与控制[11]。

  在细胞培养过程中,细胞代谢状态可以通过检测细胞培养过程中尾气中氧和二氧化碳浓度的变化进行表征,并且通过进一步的计算可以获得细胞代谢的关键参数,如氧气消耗速(OUR)、二氧化碳生成速率(CER)和呼吸商(RQ)。为了监测尾气的成分,一般使用磁质谱仪来分析氧气,红外传感器来分析二氧化碳。通过入口气体和出口气体之间含氧量的浓度差以及进出口气体的流量可以准确地估计氧气摄取率(OUR)。同样,通过分析二氧化碳浓度的差异来估计二氧化碳释放速率(CER)。

  耗氧量就是细胞代谢活动的一个关键指标,当细胞处于指数生长期,大部分的葡萄糖转化为乳酸时,耗氧速率(OUR)随着细胞浓度的增加而增加,由于目前大多数细胞培养过程都是以分批补料的培养方式进行的,补料的时间通常由细胞密度决定,因此监测耗氧速率对控制补料时间非常有用[2]。

  深层过滤、离心、微孔过滤是生物制品收获中常用的一些单元操作。收获工艺通常是对上游细胞培养步骤获得的发酵液进行进行深层过滤、离心、微孔过滤等预处理,以便下游工艺进一步纯化,目的就是最大限度地提高产物回收率,并避免产物的降解。

  在生物制品收获工艺中,PAT的应用不如其他生产阶段,与上游工艺相比,收获流程的 PAT 研究目前相对较少,这可能是认为收获步骤对最终产品质量的影响有限,因此,实施PAT技术的优势不如上游或下游流程那么重视。但是也有一些产物对稳定性等方面有独特的要求,会将 PAT 应用于此工艺阶段。

  目前在收获工艺中基础的PAT应用是应用在线浊度仪分析产品在过滤过程中的浊度情况,从而反馈发酵液在深沉过滤膜包或离心机的澄清情况。当然在这个过程中,同样会应用在线压力传感器,流量传感器实现对一些其它参数的监控。PAT技术在进行收获工艺过程中,可以更好实现工艺控制,监控发酵液的过程情况。

  在下游工艺中,通常无法将产品一次性上柱层析,需要多次分开进行,这样对于收获的产品的保存时间和保存条件有一定要求,基于这个要求,PAT技术可以很好的监控收获容器里的产品的实时情况,这更有利于工艺控制,从而实现更稳定的产品质量。在收获工艺PAT的应用中,比如同样利用在线pH传感器,在线DO传感器对已收获完成的澄清液进行监控,利用NIR 技术监测收获过程中活性药物成分(API)浓度,再如利用中空纤维膜提取分离发酵过程中产生的单克隆抗体,通过色谱采集柱或特异性 G 蛋白质分析色谱柱监测收获工艺[12]。

  基于生物制造行业在过程控制方面的发展,在生物反应器上采用计算机的在线控制,配置了pH电极、DO电极、尾气质谱仪、活细胞密度分析仪等在线分析技术的应用,实现活细胞量、葡萄糖、乳酸、氨和谷氨酰胺等胞外代谢物的浓度等多种参数的采集。随着PAT过程控制技术的应用,将在线传感器与细胞生理状态的系统模型相结合,并引入组学技术,通过建立过程数据处理方法,对数据进行分类和深入分析,可以实现数据驱动下引导过程控制并保证产品质量。

  张嗣良等[13]经过多年研究,提出了一套基于基因、细胞和反应器多尺度相关参数分析的理论。将生物反应器中复杂的生物过程分为基因尺度、细胞尺度与生物反应器尺度,不同尺度之间存在信息流、物质流和能量流。通过研究它们之间的非线性关系,以及对整个系统的影响,从而找出解决过程优化放大的方法。参数相关分析是指生物过程中的环境参数和生理参数、状态参数和过程参数、直接参数和间接参数、在线参数和离线参数之间的耦合相关性[14]。

  由于细胞培养工艺的特殊性,以及基于不同细胞培养的条件不同,对工艺设备的设计以及功能应用有一定要求。对于GMP的工艺设备,基于功能应用的条件下还需要考量GMP的合规要求,功能应用就包括了PAT的技术要求。以下表述在制药行业解决方案的不同开发商中,基于PAT技术应用的一些不同解决方案。

  基于前文描述,梅特勒公司(Mettler Toledo)与哈美顿公司(Hamilton)在pH、DO、CO2的单一传感器在线监测最为常见,应用最为广泛。对于关键参数pH、DO方面上还整合了相应的软件分析系统,可根据需要对在线或离线数据进行分析,可视化过程曲线和趋势。对于活细胞密度在线分析仪,市场常见为赛默飞Futura 在线活细胞分析,英国ABER原位活细胞浓度在线分析仪与哈美顿公司(Hamilton)的Nanotech Biomass System在线活细胞密度分析仪。

  赛多利斯公司(Sartorius)推出的 BioPAT Toolbox 产品包含分析、软件和生物处理单元,可根据不同的参数精度和变化速度,能够快速实现干预,从而让工艺参数保持在规定的规格范围内。产品专用的内联和在线分析仪可提供实时数据,实现工艺控制,从而提高生产质量。多路和离线取样分析旨在监测和确定工艺是否在定义的工艺轨迹内,或产品是否符合规范,取决于参数变化率和临界水平,实现控制和监测两个不同区域的整体方案。同样,Sartorius还包括在一次性生物细胞培养袋中整合光学pH和DO电极,以及PAT分析系统,实现细胞培养过程的过程监测与控制。

  赛默飞公司(Thermo)针对于细胞培养及发酵推出Thermo Scientific™ Prima BT and Prima PRO 工艺尾气分析质谱仪,在尾气分析方面实现突破。尾气分析质谱仪通过分析细胞培养和发酵过程中尾气中氧和二氧化碳浓度的变化进行表征,并且通过进一步的计算可以获得细胞代谢的关键参数。

  Cytiva公司通过现成的模块化解决方案KUBIO缩短产品上市时间并推迟资本支出时间,其中KUBIO的核心是FlexFactory工艺线。Cytiva的PAT技术主要体现在应用Figurate集成智能化平台助于提高工艺设施、工厂设施或全球设施的运营效率智能化技术,集中式数据管理和简化生产来改进FlexFactory工艺线。

  艾默生公司(Emerson)则是通过 DeltaV 系统提高运营性能,DeltaV分布式控制系统 (DCS) 通过易于操作和维护的智能控制来提高工厂运营,其中包括整合各种工艺设备及联动控制方式,实现精密工艺控制。DeltaV系统的内部集成可扩展到批处理、先进控制、变更管理、工程工具等功能,应用成熟的自动化系统,实现PAT并降低运营的复杂性和风险。

  如今随着生物组学技术的发展,目前的细胞培养工艺开发,已经从简单的工艺参数优化,进入系统的组学研究深度。而为了更好地满足生物制药产业发展的需求,细胞培养需要向大规模、自动化、低成本、高目的产物质量与产量发展,在这个过程中系统监测生物过程中的实际需求,特别是确定最关键的质量参数至关重要。PAT应用于细胞培养过程就在于加强关键过程参数的监控来确保蛋白药物的最终质量,而未来基于PAT技术的细胞大规模培养工艺开发,将朝着稳定产能,提高质量的方向发展。(来源猩猩森林 )